牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝(Achyranthesbidentata　Blume)的干燥根，主產(chǎn)于河南，具有補肝腎，強筋骨，逐瘀通經(jīng)，引血下行之功效，用于腰膝酸痛，筋骨無力，經(jīng)閉癥瘕，肝陽眩暈等癥[1]。牛膝是我國的傳統(tǒng)中藥，有著悠久的歷史，其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，因形似牛膝而得此名，其主要含有甾酮類、皂苷類等化學成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，牛膝具有興奮子宮[2]、抗骨質(zhì)疏松[3]、抗衰老[4]、增強免疫功能[5]、改善血液流變學[6]、治療不孕癥[7-8]等作用。小鼠巨噬細胞RAW264.7模型為目前廣泛應(yīng)用的炎癥反應(yīng)模型，現(xiàn)通過研究牛膝水煎液及甾酮類組分對脂多糖(LPS)誘導下RAW264.7細胞NO分泌量、TNF-α、IL-1β的影響，探討牛膝水煎液及甾酮類組分的抗炎作用，為研究牛膝抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制提供科學依據(jù)。

1、材料

1.1藥材與試劑

牛膝藥材(購自河北安國，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學大學張貴軍教授鑒定為莧科牛膝屬植物牛膝的干燥根)；D101大孔吸附樹脂（上海源葉生物科技有限公司）；蛻皮甾酮（成都曼思特生物科技有限公司）；二甲基亞砜(DMSO)(Gibco公司)；脂多糖(LPS)(Sigma公司)；噻唑藍(MTT)(Amresco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，北京全式金生物技術(shù)有限公司)；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)；ELISA測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2細胞株

小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.3儀器

高壓滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司)，722E型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司），細胞超凈工作臺(Esco　Laminar　Flow　Cabinet公司)，TE2000-5型倒置相差顯微鏡(Nikon公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國　Thermo公司)，酶標儀(PerkinElmer公司)，-80℃低溫冰箱(美國Thermo公司)。

2、方法

2..1牛膝水煎液及甾酮類組分的制備

牛膝藥材以10倍體積蒸餾水為溶劑，回流提取2次，每次2h，合并提取液過濾，減壓回收濃縮得牛膝水煎液提取物。水煎液上D101大孔吸附樹脂，以水、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，采用紫外分光光度法以蛻皮甾酮為對照品檢測可知50%醇洗組分為甾酮類組分，50%醇洗組分減壓回收濃縮得甾酮類組分。

2..2細胞培養(yǎng)

RAW264.7小鼠單核巨噬細胞用含10%胎牛血清、青霉素(1×105　U/L)及鏈霉素(100　mg/L)的RP-MI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%　CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

2..3對RAW264.7細胞存活率的影響(MTT法)

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞按2×105個/mL稀釋為細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，100　μL/孔，在37℃，5%　CO2條件下孵育24h，棄去上清，將含不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)液100　μL/孔加入細胞培養(yǎng)板中，空白對照組中加入無藥物的細胞培養(yǎng)液，每組6復(fù)孔，繼續(xù)孵育24　h后，每孔加入5mg/mL　MTT溶液20　μL繼續(xù)孵育4　h，棄去上清，每孔加入0.15mL的DMSO充分溶解，使用酶標儀在490nm處測定OD值。計算細胞存活率，以正常對照組細胞存活率為100%，計算各組細胞存活率。細胞存活率=A490(樣品組)/A490(空白對照組)×100%。實驗結(jié)果見表1。

2..4實驗分組

實驗取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細胞隨即分為空白對照組，LPS模型組，牛膝水煎液高、中、低劑量組，甾酮類組分高、中、低劑量組，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，共8個實驗組。

2..5對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO的影響

RAW264.7細胞以2×105/孔接種于96孔板中，置37℃，5%　CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24　h后，棄培養(yǎng)基，分別給以藥物及LPS處理，將含不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)液100　μL/孔加入細胞培養(yǎng)板中，空白對照組中加入無藥物的細胞培養(yǎng)液，每組6復(fù)孔，繼續(xù)孵育4　h，加入LPS至終濃度為1　mg/L，繼續(xù)孵育24　h后，吸取培養(yǎng)液上清0.05　mL至新的96孔板中，加入等體積的Griess試劑A　0.05　mL，室溫避光反應(yīng)5　min；再加入等體積的Griess試劑B　0.05　mL，室溫避光反應(yīng)10　min后，使用酶標儀在540　nm處測定吸光度，計算NO釋放量。實驗結(jié)果見表2。

2..6對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放TNF-α，IL-1β的影響

將RAW264.7細胞按2×105個/mL稀釋，100　μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。37℃、5%　CO2培養(yǎng)12　h。棄去上清，將含不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)液100　μL/孔加入細胞培養(yǎng)板中，空白對照組中加入無藥物的細胞培養(yǎng)液，每組6復(fù)孔，孵育4　h　，加入LPS至終濃度為1　mg/L，繼續(xù)孵育24　h后獲取細胞上清液3000　r/min離心10　min，吸取上清液按照ELISA試劑盒說明書要求進行操作，于450　nm下讀取吸光度值，計算各孔TNF-α，IL-1β的含量。實驗結(jié)果見表2。

2..7統(tǒng)計學分析

所有實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示，應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用t檢驗及單因素方差分析ANOVA(one　way　analysis　of　variance)分析方法，以P<0.05作為顯著性檢驗的標準。

3、結(jié)果

3.1對RAW264.7細胞存活率的影響

由表1可知，MTT法實驗證明牛膝水煎液組、甾酮類組在濃度小于500　μg/mL時均無明顯的細胞毒性，對細胞存活率影響在實驗允許范圍內(nèi)。故牛膝水煎液高劑量組，甾酮類組分高劑量組選擇500　μg/mL為起始質(zhì)量濃度，倍比稀釋。因此選擇625　μg/mL（對照組）、500　μg/mL（高劑量組）、250　μg/mL（中劑量組）、125　μg/mL（低劑量組）4個質(zhì)量濃度進行實驗。　

3.2對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO的影響

由表2可知，LPS可誘導RAW264.7細胞釋放NO量增加，與空白對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)；牛膝水煎液高、中、低劑量組，甾酮類組分高、中、低劑量組與模型組（LPS組）相比可顯著抑制RAW264.7細胞分泌NO的量(P<0.01)。

3.3對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放TNF-α，IL-1β的影響

由表2可知，LPS可誘導RAW264．7細胞釋放TNF-α，IL-1β的量增加，模型組（LPS組）與空白對照組相比具有極顯著差異(P<0.01)；對于炎癥因子TNF-α的釋放，牛膝水煎液高、中、低劑量組，甾酮類組分高、中、低劑量組與模型組（LPS組）相比TNF-α水平呈現(xiàn)極顯著的抑制效果(P<0.01)；對于炎癥因子IL-1β的釋放，牛膝水煎液高、中、低劑量組，甾酮類組分高、中、低劑量組與模型組，前文已寫出相比IL-1β水平也呈現(xiàn)出極顯著的抑制效果(P<0.01)。

4、討論　

牛膝，味苦、甘、酸，性平。歸肝、腎經(jīng)。用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，腰膝酸痛，筋骨無力，淋證，水腫等癥，其能夠減輕淋證的各種癥狀，對熱淋、石淋有很好的療效，是治療淋證常用藥物?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，炎癥是許多不同類型疾病的一個共同的病理基礎(chǔ)，牛膝入血分，性善下行，通絡(luò)而直搗血窠，臨床用于治療多種內(nèi)科疾病，其所治療的眾多疾病都涉及炎癥反應(yīng)，而關(guān)于牛膝抗炎作用的研究鮮有報道，故探討牛膝的抗炎作用、作用機制以及確定其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

巨噬細胞是具有異質(zhì)性的一類免疫細胞，在體內(nèi)外不同環(huán)境影響下可極化為不同表型參與生理、病理反應(yīng)，從激活方式上分為經(jīng)典激活的巨噬細胞和選擇性激活的巨噬細胞。LPS是革蘭陰性菌細胞壁最外層的一層較厚的類脂多糖類物質(zhì)，作用于受到革蘭氏陰性菌感染機體的細胞膜受體，可導致嚴重炎癥感染的發(fā)生[9]，其誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7可產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，LPS激活巨噬細胞是一個復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導過程，它是介導系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合癥的主要啟動因子，引起細胞合成和釋放NO等大量的細胞炎癥因子，導致強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)最終造成細胞的凋亡和壞死[10-11]。NO是一種具有生物活性的氣體分子，大量NO的生成與炎癥密切相關(guān)，在急性炎癥部位其會通過細胞毒性效應(yīng)引起細胞損傷，進而引起炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[12]，IL-1β是介導炎癥反應(yīng)的一種主要促炎因子，TNF-α是一種由多種免疫或非免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子,是炎癥反應(yīng)過程中最早和初級內(nèi)源性介質(zhì)，具有很強的炎癥損傷作用，在機體內(nèi)是最強炎癥介質(zhì)之一[13-16]。

現(xiàn)采用牛膝水煎液及其甾酮類組分對LPS誘導下RAW264.7細胞影響模型，研究牛膝水煎液及其甾酮類組分的抗炎作用。利用水煎煮及大孔吸附樹脂方法的組合應(yīng)用得到牛膝水煎液及甾酮類組分，結(jié)果表明牛膝水煎液及甾酮類組分在濃度小于500mg/L的范圍內(nèi)對RAW264.7細胞無顯著毒性，對存活率影響在實驗允許范圍內(nèi)。牛膝水煎液和牛膝甾酮類組分高、中、低劑量組與模型組相比可顯著抑制RAW264.7細胞NO、TNF-α，IL-1β的分泌量(P<0.01)，故牛膝水煎液和牛膝甾酮類組分能夠顯著減少RAW264.7細胞NO，TNF-α，IL-1β的釋放，具有一定抗炎作用，并呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。因此，牛膝具有抗炎作用，其物質(zhì)基礎(chǔ)為甾酮類成分，其機制可能與抑制活化巨噬細胞炎性因子NO及TNF-α，IL-1β的釋放有關(guān)，為進一步研究中藥牛膝的抗炎作用提供了理論依據(jù)。

研究牛膝水煎液及甾酮類組分對脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子的影響，探討牛膝及其甾酮類組分的抗炎作用。方法：體外培養(yǎng)RAW264.7細胞，采用MTT法檢測牛膝水煎液及其甾酮類組分對RAW264.7細胞的存活率影響，Griess法測定細胞炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的NO含量，ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β，TNF-α的含量。結(jié)果：牛膝水煎液及甾酮類組分能明顯抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO的分泌（P<0.01），以及IL-1β（P<0.01），TNF-α（P<0.01）的表達，并呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。結(jié)論：牛膝水煎液及甾酮類組分在濃度小于500mg/L的范圍內(nèi)對RAW264.7細胞無顯著毒性。牛膝水煎液及甾酮類組分可通過抑制細胞NO的分泌與IL-1β和TNF-α的表達而發(fā)揮抗炎作用。