魏靜萍

云南省紅河州蒙自市芷村鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南芷村661102

摘要從豬糞中分離引起仔豬副傷寒的病原菌并對(duì)該病原菌進(jìn)行鑒定和藥物敏感性測(cè)定。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)鑒定、生理生化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)，并參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定得到引起仔豬副傷寒的病原菌為甲型副傷寒沙門氏菌。通過(guò)藥敏試驗(yàn)，得到該分離菌對(duì)頭孢噻吩（抑菌圈24 mm）和頭孢唑啉（抑菌圈18 mm）敏感性最強(qiáng)；最不敏感的是諾氟沙星（抑菌圈為3 mm）。

關(guān)鍵詞甲型副傷寒沙門氏菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

收稿日期：2015-01-12

魏靜萍，女，1978年生，獸醫(yī)師。

沙門氏菌廣泛分布于自然界中，?？稍诟鞣N動(dòng)物，如豬、牛、羊、馬等家畜及雞、鴨、鵝等家禽，飛鳥鼠類等野生動(dòng)物的腸道中發(fā)現(xiàn)。雞是沙門氏菌最大的儲(chǔ)存宿主，各種年齡的畜禽均可感染，但幼年畜禽較易感。如豬以1～4 月齡仔豬發(fā)病較多，羊以斷乳或斷乳不久羊最易感，感染的孕畜多發(fā)生流產(chǎn)[1]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病料采自蒙自市芷村鎮(zhèn)某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)。將發(fā)病豬只的糞便無(wú)菌采集后帶回試驗(yàn)室保存在4 ℃的冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基

1）普通培養(yǎng)基。牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl5 g，水1 000 mL，pH 7.1～7.4。

2）三糖鐵培養(yǎng)基。蛋白胨20 g，牛肉浸粉5 g，氯化鈉5 g，乳糖10 g，葡萄糖1 g，蔗糖10 g，酚紅0.025 g，硫酸亞鐵0.2 g，硫代硫酸鈉0.2 g，瓊脂12 g。3）明膠液化培養(yǎng)基。蛋白胨5 g，明膠100～150 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

4）檸檬酸鹽培養(yǎng)基。檸檬酸鈉0.2 g，K2HPO40.05 g，NH4NO3 0.2 g，瓊脂1.5～2.0 g，1％酒精溶液，水100 mL。

1.3 主要試劑

1）結(jié)晶紫。溶液A：結(jié)晶紫2.5 g，95％乙醇25mL。溶液B：草酸銨1.0 g，蒸餾水100 mL。

將結(jié)晶紫研細(xì)后，加入95％乙醇使之溶解，配成A 液；將草酸銨溶于蒸餾水配成B 液，兩液混合即成。

2）盧哥氏碘液。碘1.0 g，碘化鉀2.0 g，蒸餾水300 mL。

先將碘化鉀溶解在一小部分的蒸餾水中，再將碘溶解在碘化鉀溶液中，然后加入其余的蒸餾水即成。

3）番紅染色液。番紅2.0 g，蒸餾水100 mL。

4）甲基紅指示劑。甲基紅0.02 g，95％乙醇60mL，水40 mL。配時(shí)先將甲基紅溶于乙醇后再加水。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化

先將采來(lái)的病料涂片，革蘭氏染色后，初步檢驗(yàn)是否有沙門氏菌。再進(jìn)行前增菌和選擇性增菌，然后將選擇性增菌的菌液劃線接種到分離培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色后挑取革蘭氏染色為紅色、短桿狀的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟，直至革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)一致。

1.4.2 細(xì)菌形態(tài)鑒定

1）革蘭氏染色。首先圖片固定：在載玻片上制薄的涂面，讓涂片自然晾干或通過(guò)火焰2～3 次固定；其次結(jié)晶紫染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1 min，傾去染色液，用水小心地沖洗；再次媒染：滴加革蘭氏碘液，媒染1 min 后用水洗去碘液，再將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇通過(guò)涂面脫色20～25s 至流出液無(wú)色，立即水洗；最后復(fù)染：滴加番紅復(fù)染3～5 min，用水洗去涂片上的番紅染色液，將染好的涂片放空氣中晾干或用吸水紙吸干即可。

2）鏡檢。挑選形態(tài)典型的單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，放到顯微鏡下觀察，菌體被革蘭氏染色染成紫色的為陽(yáng)性，染成紅色的為陰性。

1.4.3 生理生化鑒定

將分離得到的革蘭氏染色為陰性細(xì)菌做各種糖發(fā)酵試驗(yàn)。再進(jìn)一步做生化試驗(yàn)，如過(guò)氧化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、苯丙氨酸試驗(yàn)等。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》來(lái)確定所屬的種。

1.4.4 藥敏試驗(yàn)

將培養(yǎng)好的細(xì)菌用涂布法涂在培養(yǎng)皿上，并把各種藥敏片做標(biāo)記后放在該培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)24 h之后觀察結(jié)果。觀察抑菌圈的大小，用抑菌圈大小判定各種藥敏片對(duì)細(xì)菌的敏感程度。

1.4.5 菌種保存鑒定

將分離到的甲型副傷寒沙門氏菌球菌，經(jīng)普通的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按菌液∶20%甘油=1∶1 的比例混合，置于-20 ℃的冰箱中。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

在煌綠磺胺嘧啶培養(yǎng)基上，菌落為圓形，平板形成濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、呈淡黃色透明的、中央有凸起的菌落，同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基的顏色由紅色變成了黃色（圖1）。沙門氏菌在顯微鏡下一般觀察到的是呈桿狀的，兩端成橢圓形的，經(jīng)革蘭氏染色后為紅色，是革蘭氏陰性（圖2）。

所分離沙門氏菌的形態(tài)特征：菌落直徑約在0.5～1.5 mm 之間，凸起，圓形，光滑，淡黃色，細(xì)菌為圓形，通常都以周身鞭毛運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢、無(wú)莢膜的直桿菌。

2.2 病原菌屬特性的分析與鑒定

對(duì)從豬糞中分離得到的病原菌進(jìn)行屬的鑒定，由表1 可以看出，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，革蘭氏染色試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、乙酰甲基醇試驗(yàn)、本丙氨酸試驗(yàn)等均為陰性，根據(jù)形態(tài)特征和常規(guī)的生理生化鑒定結(jié)果，試驗(yàn)分離出的細(xì)菌確定為沙門氏菌屬。

2.3 病原菌發(fā)酵特性的分析

將分離得到的沙門氏菌屬的菌株，做進(jìn)一步的糖發(fā)酵試驗(yàn)，（www.nczfj.com）試驗(yàn)結(jié)果如表2，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行種的鑒定，可得出所分離的沙門氏菌是甲型副傷寒沙門氏菌。

2.4 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

參照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)1994 年制定的抗生素敏感度判斷標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS1994）判斷抑菌結(jié)果。抑菌圈直徑>15 mm 為高敏感度抑菌作用，用“+++”表示；10 mm<抑菌圈直徑<15 mm為中敏感度抑菌作用，用“++”表示；抑菌圈直徑<10 mm為低敏感度抑菌作用，用“＋”表示；抑菌圈直徑<5 mm 的為無(wú)抑菌作用，用“－”表示。

由表3 可知，分離的到的沙門氏菌對(duì)頭孢唑啉和頭孢噻吩敏感度高，對(duì)苯唑西林和甲氧芙啶中度敏感，對(duì)于四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素和萬(wàn)古霉素敏感度低，而對(duì)于若氟沙星不敏感。評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 分離培養(yǎng)基的選擇

從不同的基質(zhì)中分離沙門氏菌時(shí)，據(jù)沙門氏菌的生長(zhǎng)環(huán)境條件以及它在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況進(jìn)行培養(yǎng)基各種組分的選擇。對(duì)于沙門氏菌的分離，較多的人是選擇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、SS 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌[2]。在SS瓊脂平板培養(yǎng)基上可觀察到無(wú)色半透明菌落，部分菌落中間帶黑色，在麥康凱培養(yǎng)基上觀察到菌落呈透明無(wú)色、圓形凸起、濕潤(rùn)的菌落。本試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基是煌綠磺胺嘧啶瓊脂培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上可以觀察到表面光滑、邊緣整齊、呈淡黃色透明的、中央有凸起的菌落，最主要的是在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基的顏色由紅色變成了黃色，這是沙門氏菌培養(yǎng)最顯著的特點(diǎn)。

3.2 細(xì)菌的分離鑒定

細(xì)菌的分離鑒定方法很多，可以是常規(guī)的細(xì)菌分離鑒定，也可以是分子生物學(xué)的鑒定，包括DNA測(cè)定、PCR 技術(shù)、血清鑒定等現(xiàn)代技術(shù)。較多的人是采用分子鑒定方法，PCR 技術(shù)對(duì)檢測(cè)豬沙門氏菌具有特異性高、靈敏、快速等特點(diǎn)，適用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)豬傷寒沙門氏菌，是一種快速簡(jiǎn)便、靈敏特異檢測(cè)沙門氏菌的方法[3]。用PCR 技術(shù)檢測(cè)豬個(gè)體中的傷寒沙門氏菌，結(jié)果具有高度的特異性和敏感性。但先進(jìn)缺點(diǎn)是得不到純培養(yǎng)的細(xì)菌[4]。本試驗(yàn)是用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法，這一方法包括了前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、純化培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)6 個(gè)步驟。該方法是目前世界各國(guó)普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)方法，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，同時(shí)得到純培養(yǎng)的細(xì)菌。

3.3 分離菌的耐藥性

甲型副傷寒沙門氏菌為臨床常見(jiàn)致病菌，致病具有一定的流行性，一旦流行暴發(fā)，危害極大。目前抗菌藥物種類繁多，使用量大，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重。較多數(shù)人做的藥敏試驗(yàn)是采用頭孢噻肟、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、哌拉西林、氨芐西林、氯霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、阿莫西林等。其結(jié)果是甲型副傷寒沙門菌對(duì)三代頭孢菌素（頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟）100％敏感。對(duì)喹諾酮類（氧氟沙星、環(huán)丙沙星）100％敏感。對(duì)復(fù)方新諾明93.6％敏感。對(duì)氯霉素和氨芐西林、氨芐西林／舒巴坦、阿莫西林／棒酸等高度敏感[5-7]。本研究主要是對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻吩、苯唑西林、甲氧芙啶、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素、萬(wàn)古霉素、若氟沙星等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果是分離得到的沙門氏菌對(duì)頭孢唑啉和頭孢噻吩敏感度高，對(duì)苯唑西林和甲氧芙啶為中度敏感，對(duì)于四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、青霉素和萬(wàn)古霉素敏感度低，而對(duì)諾氟沙星最不敏感。因此，臨床醫(yī)生在進(jìn)行藥物治療前，應(yīng)該根據(jù)本地區(qū)目前的藥敏試驗(yàn)情況選用抗菌藥物，應(yīng)盡快采集標(biāo)本作細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，以便為治療提供可靠依據(jù)。

4 結(jié)論

4.1 沙門氏菌分離結(jié)果

本試驗(yàn)是采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生理生化特點(diǎn)，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定出從病料中分離出來(lái)的沙門氏菌，并根據(jù)各種生理生化試驗(yàn)鑒定出它是致病性甲型副傷寒沙門氏菌。

4.2 沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)本試驗(yàn)的藥敏片產(chǎn)生的抑菌圈的大小知道，頭孢唑啉和頭孢噻吩的抑菌圈最大，敏感度高；苯唑西林和甲氧芙啶的抑菌圈在10～15 mm 之間，中度敏感；萬(wàn)古霉素、紅霉素、青霉素、氯霉素、四環(huán)素的抑菌圈在5～10 mm 之間，敏感度低；若氟沙星的抑菌圈在5 mm以下，最不敏感。

參考文獻(xiàn)

[1] 金鑫，蘇敬良.人獸共患病的現(xiàn)狀與防制（十五）- 沙門氏菌病[J].云南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，2（30）：12-16.

[2] 劉俊偉，張海棠，張志鵬，等.規(guī)模化豬場(chǎng)豬霍亂沙門氏菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（4）：146-148.