摘要：本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素（FSH）和孕馬血清促性腺激素(PMSG)處理，比較卵巢上2～8　mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。結(jié)果表明：6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細(xì)胞數(shù)（58.3±1.7、41.6±3.2）都高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)（16.7±2.6、10.5±2.1；19.6±4.5、11.8±1.6），且差異顯著(P＜0.05)。6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞受精后的卵裂率(64.1％±1.5％、63.8％±3.4％)及囊胚率(31.2％±1.9％、30.4％±3.7％)略低于成母羊組(67.4％±3.7％、34.4％±1.2％)，但沒有顯著差異(P>0.05)。

通過外源激素誘導(dǎo)，從羔羊獲得大量卵母細(xì)胞，受精后進(jìn)行胚胎移植，能顯著提高良種母羊的繁殖潛力、縮短世代間隔，加速遺傳改良進(jìn)程。本研究旨在比較小尾寒羊6周齡、13周齡羔羊、成母羊激素處理后卵巢卵泡發(fā)育及對(duì)體外胚胎發(fā)育的影響。通過促卵泡激素和孕馬血清促性腺激素處理，比較卵巢上2～8　mm卵泡的數(shù)量及體外胚胎的發(fā)育情況。

1材料與方法

1.1母羊選擇

分別于2016年4、5、6月份，選擇體況良好、年齡分別為成母羊、6周齡、13周齡羔羊各9只，共有27只，品種為小尾寒羊。

1.2母羊激素處理方案

成母羊組及羔羊組（6周齡組、13周齡組），分別在先進(jìn)、二、三天的早6：00、晚18：00時(shí)肌肉注射2.5mL、1.5mL、1.0mL　FSH(20IU／mL)，并在最后一次注射FSH同時(shí)每只羔羊加注0.4　mL　PMSG(500　IU／mL)。

1.3卵母細(xì)胞的采集

母羊在注射FSH　48h后空腹、術(shù)部剪毛，在母羊腹下切一個(gè)切口，引出卵巢，用吸有約2　mL抽卵液　TCM199(5％發(fā)情羊血清、100IU／mL肝素、100g／mL鏈霉素、100IU／mL青霉素)的10mL注射器(接12號(hào)針頭）吸一個(gè)卵巢表面2～8mm的卵泡。在實(shí)體顯微鏡下檢出A、B級(jí)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），記錄所采集的COCs數(shù)，分別比較成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及采集的卵母細(xì)胞數(shù)。

1.4卵母細(xì)胞的體外成熟

將采集到的卵母細(xì)胞在38.5℃、5%　CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱進(jìn)行24　h的成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)法，滴上覆蓋石蠟油。在直徑為35　mm　的細(xì)胞培養(yǎng)皿作6～8個(gè)滴（100μL/滴），在培養(yǎng)箱預(yù)平衡2　h。成熟培養(yǎng)液為TCM-199（10％胎牛血清、10　μg／mL促卵泡激素、1　μg／mL促黃體激素、1　μg／mL雌二醇）。

1.5卵母細(xì)胞的體外受精

卵母細(xì)胞體外成熟24h后，挑選顆粒細(xì)胞擴(kuò)散效果較好的進(jìn)行受精。受精液為合成輸卵管液(synthetic　oviduct　fluid，SOF)并添加20％發(fā)情羊血清、10μg／mL肝素、3%牛脫脂血清白蛋白（BSA）。羊冷凍精液在37℃水浴中解凍15s，然后將解凍后的精液緩慢加入5mL精子洗滌液SOF（10%發(fā)情羊血清、10μg／mL肝素）混勻后進(jìn)行離心(1500r／min，5min)，離心沉淀后的精子團(tuán)再用5mL　HSOF離心洗滌(1000r／min，5min)1次。去上清液后，用受精液將精子密度稀釋至5×106個(gè)／mL用于體外受精。體外成熟的卵母細(xì)胞在受精液中洗1～2次，每20個(gè)卵母細(xì)胞移入50μL受精液滴中。

1.6早期胚胎的體外培養(yǎng)

精子與卵子受精培養(yǎng)24　h后在SOF液中洗滌2次后，移入預(yù)先在培養(yǎng)箱內(nèi)平衡2　h培養(yǎng)滴內(nèi)。將20～25枚受精卵分別移入100μL的發(fā)育培養(yǎng)液SOF(2％的必需氨基酸、1％的非必需氨基酸、2　mmol／L的谷氨酰胺、3　mg／mL　BSA、10　ng/mL　上皮生長因子）中，在38.5℃　、5%　CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7～8天。48　h統(tǒng)計(jì)卵裂率，每隔48　h半量更換培養(yǎng)液。第8天，統(tǒng)計(jì)囊胚率。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件@Independent-samples　t檢驗(yàn)和One-way　ANOVA進(jìn)行方差分析。

2.結(jié)果

2..1成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)比較

由表1可知，6周齡羔羊卵巢發(fā)育的卵泡數(shù)和采集到的卵母細(xì)胞數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于13周齡羔羊及成母羊的卵泡數(shù)和卵母細(xì)胞數(shù)，且差異顯著(P<0.05)。摘取卵巢組卵母細(xì)胞獲得率（80%）顯著高于活體采卵組（65%）。

2..2羔羊個(gè)體差異對(duì)激素誘導(dǎo)效果的影響

在本試驗(yàn)中，通過激素誘導(dǎo)羔羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有8只，5只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應(yīng)(見表2)。

2..3成母羊、6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力及不同取卵方式對(duì)體外胚胎發(fā)育能力的比較

由表3可見，6周齡、13周齡羔羊卵母細(xì)胞受精后的卵裂率及囊胚率與成母羊組沒有顯著差異（P>0.05）。其中成母羊組卵裂率及囊胚率略好于羔羊組。不同的取卵方式對(duì)體外胚胎的發(fā)育能力影響差異不顯著。

3討論

3.1母羊年齡對(duì)卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)的影響

不同月齡的母羊經(jīng)外源激素處理后卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)差異很大。6周齡羔羊卵巢上發(fā)育的卵泡數(shù)及卵母細(xì)胞數(shù)最多，顯著地多于13周齡羔羊及成母羊（P<0.05）。于勇等[1]試驗(yàn)證明：1月齡、3月齡羔羊超排處理效果上的差異與血液中FSH水平有關(guān)，較高的FSH水平會(huì)促進(jìn)卵巢上卵泡發(fā)育。本研究結(jié)果也證明了這一結(jié)論。

3.2個(gè)體差異對(duì)激素誘導(dǎo)效果的影響

在本試驗(yàn)中，通過激素誘導(dǎo)母羊卵泡發(fā)育，羔羊之間差異較大。在獲卵總數(shù)方面，獲卵數(shù)量小于25枚的有4只，大于45枚的有7只，3只獲卵數(shù)量在25～45枚之間，1只羔羊沒有反應(yīng)。可見，激素誘導(dǎo)羔羊卵泡發(fā)育存在較大的個(gè)體差異。這個(gè)結(jié)果與成年母羊的激素誘導(dǎo)效果相似。

3.3母羊年齡及不同取卵方式對(duì)卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

本試驗(yàn)表明，6周齡、13周齡的羔羊所獲卵母細(xì)胞在體外成熟、體外受精后的桑葚胚和囊胚率接近于成母羊(P>0.05)。趙宏遠(yuǎn)[2]試驗(yàn)證明，30～50日齡組與51～70日齡組所獲得卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力差異不大。Morton[3]試驗(yàn)證明，6～7周齡羔羊比3～4周齡羊卵母細(xì)胞體外受精后囊胚率高(21.4％VS17.4％)。陳曉勇等[4]報(bào)道，羔羊卵母細(xì)胞與成年羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力是否有差異尚存在爭議。Jorio等[5]研究表明，隨著年齡增長卵母細(xì)胞在體外的發(fā)育能力增強(qiáng)，成年羊的卵母細(xì)胞發(fā)育能力強(qiáng)于羔羊，本試驗(yàn)結(jié)果證明羔羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力略次于成年母羊的。造成此現(xiàn)象的原因除了年齡因素外，也與體外培養(yǎng)體系、個(gè)體體況差異等因素有關(guān)，但其內(nèi)在的機(jī)理還不是很清楚，需要擴(kuò)大群體數(shù)量進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)成母羊及6周齡、13周齡羔羊進(jìn)行FSH+PMSG外源激素處理，發(fā)現(xiàn)6周齡羔羊在激素誘導(dǎo)后卵巢上卵泡數(shù)顯著高于成母羊及13周齡羔羊，獲得的卵母細(xì)胞數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成母羊及13周齡羔羊；獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)過體外成熟、體外受精、早期胚胎體外培養(yǎng)試驗(yàn)后，6周齡羔羊卵母細(xì)胞體外成熟、受精后發(fā)育的囊胚率與成母羊及13周齡羔羊結(jié)果相近。羊是多胎動(dòng)物，一個(gè)卵巢上可以同時(shí)排多個(gè)成熟卵子，為了提高卵母細(xì)胞獲得率，摘除一個(gè)卵巢并不會(huì)影響母羊以后的繁殖性能。

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